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菌落计数常识

菌落总数的测定方法看似很简单，但由于食品种类繁多，食品中可能存在很多微生物菌群。在相同的条件下培养所有的细菌并反映样品的真实情况并不容易。

一、能力实验的目的

能力验证试验是检验实验室检测能力和提高检测水平的重要手段。利用实验室间的比较来判断实验室的校准或检验工作。

至关重要的是，能力验证是检验实验室检验能力的外部质量活动。主办方提供测试样本，一般认为在菌落总数上增加了上述难度。

二、判定标准

食品国家标准：GB 4789.2-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

三、操作流程

(1)做好充分的前期准备：

根据国家标准，准备平板计数琼脂、平皿、试管、稀释液(生理盐水)、三角瓶等。提前使用。

(2)样品的验收：

收到样品后，确认样品的包装是否完好，并在2~8冰箱中保存，然后在能力验证平台上确认。

(3)样品处理：

按照作业指导书(一定要仔细阅读作业指导书)看有没有几个样品和实验记录。通常，实验室接收干粉样品或固体样品。如果收到干粉样品，第一步就是水合。

样品水化步骤(建议):一般能力验证样品以国家粉末形式发放，以液体形式上报(CFU/毫升)。样品水化前，一定要仔细阅读操作说明书，看水化用了多少稀释剂，记录为原液或水化后的样品是什么浓度。

(4)实验前的准备：

A.能力验证时最好在超净台或生物安全柜内操作，这样超净台或生物安全柜要提前清洗消毒，保证实验环境的无菌性。

B.放好盘子，试管，稀释剂等。要提前用在手术台上。

(5)实验操作：

一、稀释

将样品从冰箱中取出至室温，打开使用。在超净台或生物安全柜下用少许稀释液(精选生理盐水)水化，然后吸至无菌瓶或袋中，再用剩余稀释液冲洗后全部转移至无菌瓶或袋中。(需要多少稀释剂取决于工作说明书中的说明)

洗涤时注意样品瓶盖的清洁和无菌操作，将所有水化液混合均匀，一般立即接种作为原液；然后，将25-225毫升稀释液混合均匀，制成10-1梯度的样品匀浆。

用1ml无菌移液管取1:10样品溶液到9ml生理盐水试管中，制成1:100样品溶液，以此类推。然后将样品溶液的几种稀释液接种到预先标记的无菌平板中。

b、倒药片

将事先冷却至46的平板计数营养琼脂培养基倒入平板中约15ml，旋转平板，混匀。同时将营养琼脂培养基倒入灭菌平板中，加入1ml稀释液(不含样品)作为空白对照。在倒菜过程中，一般左手拿着菜，右手拿着琼脂瓶，左手将菜的缝隙打开30度左右，将琼脂倒入碗底的一半左右，左三圈和右三圈轻轻搅拌，然后放在桌上。

琼脂凝固后，翻转平板，在361培养箱中培养482h。

e、观察和计数

最好第二天看一下，检查结果有没有异常，有没有扩散的菌落。

菌落计数按GB 4789.2进行。

f、报告数据

分析结果后，选取检测结果的平均值进行网络提交。

注意事项：

A.一般能力验证的样品添加的菌落浓度比较高，所以检测过程中必须做更多的稀释，每次稀释要平行更多的平板。

B.梯度稀释：是关键步骤，一定要尽可能减少误差(新手建议涡旋混合均匀，涡旋时间不要太长，长时间离心力作用下微生物细胞可能会死亡)。

C.培养基

d、倾注培养基的量不同，从12到20 ml不等。一般15ml比较合适。板材太厚会影响观察，太薄容易开裂。倾倒时，如果培养基底部有沉淀物，应丢弃底部，以免与菌落混淆，影响计数观察。

E.倒的过程一定要控制好，琼脂绝对不能减少。

f、为了使菌落在平板上均匀分布，试液加到平板上时应尽可能放在中央部位，然后尽快倒入培养基并旋转混合，可正反向旋转。从稀释到倒最后一盘的时间不能超过20min，以免细菌死亡或繁殖。

g、琼脂瓶放入水浴前一定要搅拌均匀，防止平板凝固；倒出时，用喷有75%酒精的抹布擦拭干净。

h，不用担心冷却过程。待冷却充分后，将其倒置于培养箱中培养。摆放时尽量避免放在扇口处，每叠不超过6盘。

一、检验结束后，所有稀释液样品必须放入冰箱0-5冷藏备用(第二天一次，发现实验做错了，正在做另一个实验，死马当活马医)。

试管的成功率与女性的年龄密切相关。年龄越小，成功率越大，但核心还是取决于女性的卵巢功能。只要卵巢功能好，卵子排出，排出的卵泡质量好，试管成功率自然很高。所以，想要知道成功率有多高，需要提前检查卵巢，了解自己的卵巢功能，才能进行评估。

试管成功率和女性年龄有很大关系，但最终决定成功率的还是女性的卵巢功能。有些女性虽然年纪大了，但是卵巢功能还是很好的，卵子排出来了。这种情况下试管成功率很高，医生通常会对其采取短期引流方案。所以，想要知道成功率有多高，需要提前检查卵巢，了解自己的卵巢功能。

成功率很难说，因为就算你做了，也没有医院能保证你成功。我有这样一个四十多岁的女人，做过一次试管，失败了。

如果卵巢功能不好，首先要看年龄。第二，要看卵巢功能不好到什么程度。比如患者40岁，卵巢功能不好，那么成功率就比较低。检查结束后会根据FSH、LH、基础卵泡刺激素、年龄向患者详细说明成功率。如果是年轻患者，卵巢功能差只是因为手术损伤。这个患者虽然卵巢功能差，但可以获得更优质的卵子，成功率肯定比卵巢功能差、FSH相同、基础水平相同卵巢功能差的老年患者高很多。一般来说，卵巢功能不好会降低同年龄或同水平的人的成功率，因为会影响卵子的质量。