前几期主要是介绍了关于逆转录实验的相关内容，接下来的几期中，小翌将带大家进入
qPCR
世界中，一起感受
qPCR
最美曲线的魅力。本期主要介绍
qPCR
的基础知识和原理。
PART 01
什么是qPCR？
实时荧光定量
PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）
是利用荧光信号的变化实时检测
PCR
扩增反应中每一个循环扩增产物变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，是一种研究基因表达量的重要方法。
1
qPCR和普通PCR的区别
qPCR实质上是一种PCR扩增反应，但它与普通PCR有所不同。普通PCR是将的得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过核酸染料染色并借助紫外凝胶成像仪进行观察，最后通过终产物进行定性或者半定量分析；qPCR是在反应体系中引入荧光基团（染料或者探针），进而对qPCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应的过程，结合相应的qPCR仪自带软件可对产物进行分析，并计算出待测样品模板的初始浓度。
图1.普通PCR琼脂糖凝胶电泳图
图2.qPCR扩增曲线图
2
qPCR的种类
根据
qPCR
的化学发光原理一般分为2大类：一类是探针法，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类是基于
SYBR Green I
的染料法，通过荧光染料来指示产物的增加。
探针法
：
探针的5'端标记一个报告荧光基团，3'端标记一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光被淬灭基团吸收，此时不发光；在PCR扩增过程中，Taq酶的
5'-3'
的外切酶活性会将探针的5'报告荧光基团切开，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发光，从而被荧光检测系统接收。
图3.探针法qPCR实验的原理图（图来源于网络）
染料法
：
染料与DNA双链结合时，在激发光源的照射下发出荧光信号，其信号强度代表双链DNA分子的数量。随着PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也会增大。目前主要使用的染料分子是
SYBR Green I，
能与DNA双链的小沟特异性地结合，游离的
SYBR Green I
几乎没有荧光信号，但结合DNA后，它的荧光信号可呈百倍增加。因此
，PCR
产物越多
，SYBR Green I
结合越多，荧光信号则越强。
图4.染料法qPCR实验原理图（图来源于网络）
PART 02
qPCR的原理
1
qPCR仪器工作原理
qPCR
仪器是由荧光定量系统和计算机组成，主要包括这三个反应模块：激发光发射源，接收装置
，PCR
反应模板。在
PCR
反应模块中进行qPCR反应，当仪器的激发光发射源发出一定波长的光线，遇到
qPCR
反应体系中的荧光基团则会反射另外一个波长的光线，此时被接收装置实时接收，接收的数据传送至计算机，计算机将相应的数据通过实时分析软件转化为扩增和熔解曲线。
图5.qPCR仪器工作原理图（图来源于网络）
2
qPCR的数学原理
qPCR中有3个比较重要的参数：基线、阈值和Ct值。基线是指3-15个循环的荧光值；阈值是指基线标准差的10倍；Ct值是指荧光值达到阈值线时所对应的循环数；
图6.qPCR扩增曲线图
qPCR的数学原理如图7所示：
图7.qPCR的数学原理和标准曲线图
从线性方程可以看出
，lg(N
0
初始模板量)与Ct值呈负线性关系，即模板拷贝数越多，其Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品绘制标准曲线，根据荧光基团发出的荧光强度与PCR 扩增产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行实时监测并得到未知样品的Ct值，即可通过标准曲线计算未知样品的起始拷贝数。
PART 03
精品推荐
针对
qPCR
实验，翌圣生物基于染料法研发了一款适用于所有qPCR仪器的荧光定量试剂盒
——Hieff UNICON
Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix。
该产品采用抗体法修饰，同时配方添加了基因扩增的促进因子，大大提升了该产品的扩增性能。
1
一款产品，无需调整 ROX 浓度，通用全仪器平台
图8. Hieff UNICON
Universal Blue 预混液可实现全平台通用。针对不同仪器平台，与T品牌对比，Hieff UNICON
Universal Blue 预混液Ct值起峰更加靠前。以2 L的质粒10倍梯度稀释液为模板，扩增
IL23R
基因。
2
灵敏度高，可检测低至 A
图9.Hieff UNICON
Universal Blue 预混液可有效检测7个数量级范围的模板量，扩增效率高，可在宽广的线性范围内获得良好的线性关系。以2 L的10
6
-10
0
拷贝/L的质粒为模板，扩增人
IL23R
基因。
3
检出率和特异性良好，广泛适用于不同GC含量基因
图10. Hieff UNICON
Universal Blue预混液可实现不同引物的高特异性扩增。 以293T细胞cDNA为模板，利用Primer5软件设计200 bp扩增长度的片段（GC%含量30%-70%）的引物共1000对，随机挑选27对，使用Hieff UNICON
Universal Blue预混液检测引物的扩增效率和反应特异性，在宽广的基因GC范围内，该预混液可保证极高的特异性基因检出。
4
精准度高，复孔重复性好
图11. Hieff UNICON
Universal Blue预混液可精准分辨2倍表达量差异，且具备良好的重复性A: 以293T细胞cDNA原液进行2倍梯度稀释，扩增
GAPDH
基因，Hieff UNICON
Universal Blue预混液可精准区分2倍模板浓度差异。B: 以293T细胞20倍cDNA稀释液为模板，扩增
GAPDH
基因，设置90个复孔，Ct值标准偏差＜0.2。
5
良好的稳定性，让体系配制更加灵活
图12. Hieff UNICON
Universal Blue预混液在体系配制后4℃放置不同时间条件下，检测人
C2orf68
基因扩增情况。结果显示体系配制后4℃保存24 h，扩增性能无变化。
病情分析：您好，根据您的以上这些内容的描述，您的情况考虑是试管，咳嗽是不行的指导意见：您好，像您的这种情况考虑是治愈后试管比较好的，这种情况试管后容易流产的
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